【摘要】目的建立骨康口服液中有效成分的含量測(cè)定方法。方法采用HPLC法測(cè)定骨康口服液中有效成分含量。結(jié)果補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素兩種成分均達(dá)到良好分離，在測(cè)定范圍內(nèi)線性良好，回收率均在99%～101%之間。結(jié)論所建立的定量方法簡(jiǎn)便可行、重復(fù)性好，可作為骨康口服液的質(zhì)量監(jiān)控。

　　【關(guān)鍵詞】  骨康口服液 補(bǔ)骨脂素 異補(bǔ)骨脂素 液相色譜法

　　Abstract:ObjectiveTo establish a method of HPLC for determining psoralen and isopsoralen in Gukang Oral Liquid. MethodsThe effective components in Gukang Oral Liquid were determined by HPLC. ResultsThe resolution and the linearity were fine with the rate of recovery of psoralen 99.96%,RSD＝1.16%; the recovery rate of isopsoralen was 100.09%,RSD=0.60%.ConclusionThe quantitative method for determining the ingredients of Gukang Oral Liquid is simple, feasible and repeatable, and can be used for quality control of Gukang Oral Liquid.

　　Key words:Gukang Oral Liquid;   Psoralen;   Isopsoralen;   HPLC

　　骨康口服液由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、白芍、黃芪等10味藥材組成，具有補(bǔ)腎壯骨，活血通絡(luò)，健脾益氣的功效， 臨床上主要用于治療婦女更年期引起的骨質(zhì)疏松癥。骨康口服液復(fù)方共煎，有利于補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的煎出［1,2］，故采用水提醇沉工藝制備［3］。鑒于補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素可相互轉(zhuǎn)化［4,2］，原標(biāo)準(zhǔn)采用TLCS法測(cè)定補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素兩者的總量［5］。但TLCS法變異大，故選用HPLC法同時(shí)測(cè)定骨康口服液中補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的含量?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

　　1  儀器與試藥

　　DIONEX SUMMIT液相色譜儀（PDA-100檢測(cè)器、STH585柱溫箱、P680 HPLC泵、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器）,Chromeleon色譜工作站；補(bǔ)骨脂素（供含量測(cè)定用，110739-200309）、異補(bǔ)骨脂素（供含量測(cè)定用，110738-200410），均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；骨康口服液（批號(hào)：20061009，20061012，20061015），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開(kāi)發(fā)研究中心提供；乙腈為色譜純（Merck，1192230）其他試劑均為分析純。

　　2  方法與結(jié)果

　　2.1  色譜條件

　　色譜柱：Phenomenex luna C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%冰醋酸為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；流速：1.0 ml·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl；理論塔板數(shù)均不低于3 000。

　　2.2  溶液的制備

　　2.2.1  對(duì)照品溶液的制備

　　精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品適量，分別置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，以此作為對(duì)照品貯備液。精密吸取上述各對(duì)照品貯備液適量，加甲醇制成每毫升含補(bǔ)骨脂素35 μg，異補(bǔ)骨脂素44 μg的混合溶液，搖勻即得。

　　2.2.2  供試品溶液的制備

　　取本品10支，混勻，精密吸取藥液10 ml，加乙醚提取4次，10 ml/次，分取乙醚層，60℃揮干乙醚, 用甲醇溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

　　2.2.3  陰性對(duì)照溶液的制備

　　取處方中除補(bǔ)骨脂外的其余成分制成缺補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下的供試品制備方法處理得缺補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照液。

　　2.3  線性關(guān)系考察

　　精密吸取對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，14μl進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定基線構(gòu)成之面積稱峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面積，并以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，補(bǔ)骨脂素在70～490 ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，異補(bǔ)骨脂素在88～616ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程分別為：補(bǔ)骨脂素：Y=8224.5X-48.132 6, r=0.999 9；異補(bǔ)骨脂素：Y=7 371.7X-52.475 2, r=0.999 9。

　　2.4  精密度實(shí)驗(yàn)

　　精密吸取上述補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液10 μl連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積積分平均值補(bǔ)骨脂素為3 211.929，RSD為0.07%；異補(bǔ)骨脂素為3 676.707，RSD為0.16%，表明分析方法精密度良好。

　　2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

　　按照擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)同一批樣品（批號(hào)：20061009）制備供試品溶液，平行操作6份，結(jié)果測(cè)得補(bǔ)骨脂素平均含量為0.075 mg·g-1，RSD為2.39%；異補(bǔ)骨脂素平均含量為0.072 mg·g-1，RSD為2.54%，表明本測(cè)定方法具有較好的重復(fù)性。

　　2.6  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

　　精密吸取同一供試品溶液10 μl，在0，2，4，8，12 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果：補(bǔ)骨脂素平均峰面積為1 330.393，RSD為0.46%；異補(bǔ)骨脂素平均峰面積為1 056.411，RSD為1.6%，表明樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.7  專屬性實(shí)驗(yàn)

　　取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液,按本色譜條件各進(jìn)樣10 μl。結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，在本色譜條件下,陰性對(duì)照無(wú)干擾。

　　2.8  加樣回收率實(shí)驗(yàn)

　　精密吸取已知含量的同一批樣品（20061009）10 ml，分別精密加入一定量的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備并測(cè)定，按公式回收率（P）（%）=（測(cè)得量-加入量）/樣品量×100%計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。表明本方法具有良好的回收率。表1  骨康口服液中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的HPLC測(cè)定梯度洗脫條件（略）表2  加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表3  樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量測(cè)定結(jié)果（略）

　　2.9  樣品測(cè)定

　　取骨康口服液3批,照上述方法處理后測(cè)定,記錄峰面積,代入回歸方程計(jì)算樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

　　3  討論

　　3.1  提取溶媒的選擇

　　本品處方由多味中藥組成，且由水煎煮濃縮制得，活性成分多，極性強(qiáng)，影響鑒別的干擾因素較多。筆者曾用水直接稀釋樣品進(jìn)樣分析，結(jié)果雜質(zhì)峰較多，分離效果差?？紤]到補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素為呋喃香豆素類成分，因此采用乙醚提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法可使樣品中的補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素提取*。

　　3.2  流動(dòng)相的選擇

　　目前《中國(guó)藥典》2005年版和文獻(xiàn)報(bào)道中HPLC法測(cè)定補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素大多采用甲醇-水體系［6～9］，但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些體系均不適用于該制劑的分析，本文選用乙腈-0.1%醋酸溶液梯度洗脫，可以同時(shí)測(cè)定補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的含量，且獲得較好的分離效果，且峰形更佳。本法操作簡(jiǎn)便，精密度高，重現(xiàn)性好，是控制骨康口服液內(nèi)在質(zhì)量的有效方法。

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